胚胎干细胞基质胶的准备和存储

　　胚胎干细胞基质胶的准备和存储需严格遵循温度控制、无菌操作及分装规范，以下是具体步骤和注意事项：

　　一、存储条件

　　1.长期保存

　　温度：-20℃或-80℃（推荐-80℃以减少温度波动影响）。

　　位置：避免放置在冰箱门侧，防止反复开关导致温度不稳定；优先选择内侧角落。

　　状态：含酚红基质胶冷冻时为淡黄色/橙黄色，解冻后为红色；不含酚红者冷冻时呈碎冰样白色，解冻后为半透明浓稠浊液（高浓度）或近乎透明（低浓度）。

　　2.运输要求

　　需干冰运输，确保全程低温，防止基质胶提前成胶或变质。

　　二、胚胎干细胞基质胶解冻与分装

　　1.解冻步骤

　　一次解冻：将基质胶包装瓶半埋于碎冰中，置于2-8℃冰箱过夜，直至全融化。

　　后续使用：每次取出所需量后立即放回-20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

　　2.分装操作

　　预冷耗材：将1.5mLEP管、移液枪头、离心管等置于-20℃冰箱预冷1小时以上。

　　冰上操作：所有分装步骤需在冰上进行，防止基质胶因温度升高而聚合。

　　3.分装方法：

　　用预冷的移液器将融化的基质胶分装至预冷的EP管中。

　　分装时可用无菌剪刀剪去吸头端，每分装5管后更换新吸头，减少堵塞风险。

　　保存：分装后的基质胶迅速转移至-20℃或-80℃冰箱保存。

　　三、胚胎干细胞基质胶使用前准备

　　1.稀释基质胶

　　稀释液：常用无血清培养基或PBS。

　　比例：根据实验需求调整稀释比例，但稀释后浓度不可低于4mg/ml，以保证成胶性能。

　　操作：将预冷的稀释液加入解冻的基质胶中，反复吹打混匀（至少20次），避免产生气泡。

　　2.包被培养板

　　操作：

　　将稀释后的基质胶均匀铺于培养板底部，轻轻摇晃使分布均匀。

　　置于37℃培养箱孵育30分钟至1小时，使基质胶聚合形成三维胶质结构。

　　包被后的培养板可密封后置于4℃保存，两周内使用；使用前需恢复至室温30分钟以上。

　　四、注意事项

　　1.温度敏感：基质胶在10℃以上会逐渐成胶，操作时需全程冰上进行，且所有试剂耗材需预冷。

　　2.无菌操作：所有步骤需在生物安全柜内进行，避免污染。

　　3.避免沉淀：若解冻后基质胶出现少量沉淀，可4℃低速离心后使用，通常不影响活性。

　　4.浓度控制：稀释后浓度过低（<4mg/ml）可能导致成胶失败，需严格按比例稀释。

　　5.细胞混合：若需将细胞与基质胶混合（如皮下成瘤实验），需在冰上操作并尽快使用，防止基质胶聚合影响细胞分布。